维生素B12缺乏的确定，主要通过血清维生素B12测定、尿甲基丙二酸测定以及维生素B12吸收试验进行测定。
1、血清维生素B12测定：血清维生素B12测定是诊断维生素B12缺乏的常用方法，该方法通常使用微生物法和放射免疫法进行测量，其中放射免疫法的敏感度和特异度均高于微生物法，并且测定更方便。正常人的血清维生素B12水平通常在200-900pg/ml，如果低于100pg/ml，则可诊断为维生素B12缺乏。
2、尿甲基丙二酸测定：尿甲基丙二酸测定可以反映体内甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰CoA的情况，在维生素B12缺乏的情况下，甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A的过程会受阻，导致体内甲基丙二酸量增多并从尿中大量排出。正常人在尿中仅排出微量，而维生素B12缺乏的人尿中甲基丙二酸量会明显升高。
3、维生素B12吸收试验：维生素B12吸收试验可以检测肠道对维生素B12的吸收情况，在试验中，受试者需空腹口服57钴标记的维生素B12，然后在2小时后肌注未标记的维生素B12，之后收集24小时尿测定排出的放射性。正常人的排泄率应超过7%，如果低于7%，则表示维生素B12吸收不良。
参考资料：王焱,万芙荣,周靖主编；徐文伟,潘文萍,黄爱 玲,刘明倩,毕延萍,张晓倩副主编,血液病知识问答,军事医学科学出版社,2010.10,第36页