大肠杆菌单染色法实验方法包括涂片、干燥、固定、染色，具体如下。

• 涂片：取载玻片一张拭净，接种环火焰灭菌，取生理盐水一滴，放在载玻片中央。左手斜持菌种管，右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰，将接种环插入管中取菌少许。取好菌后，管口及棉塞均需火焰灭菌后，再塞好棉塞。将接种环上的细菌加入载玻片上的水滴内磨匀，涂成直径约1cm的菌膜。最后将接种环经火焰灭菌。

• 干燥：涂片置于空气中，使其自然干燥。

• 固定：干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次。

• 染色：在固定后的标本上加亚甲蓝染液以覆满标本为度，染色1-2分钟。细流水自载玻片一端徐徐经过标本冲洗。待其自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。

由于大肠杆菌微小，加之它与周围的水环境光学性质相近，从而用一般光学显微镜不易看到它。通常用染色的方法增加反差，有助于细菌标本的观察，单染色法即仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，可用来观察细菌的形态和排列方式，但无鉴别细菌的作用。