行阴道后穹窿穿刺术时患者应排空膀胱，取膀胱截石位，用聚维酮碘溶液消毒外阴。通过阴道检查了解子宫、附件情况，阴道窥器应充分暴露宫颈及阴道后穹窿并消毒。

接下来使用宫颈钳夹持宫颈后唇并向前牵引，充分暴露阴道后穹窿。阴道后穹窿暴露后，用腰椎穿刺针，于后穹窿中央处，水平稍向后方向刺入，当有落空感时进针2-3cm，试行抽吸。抽吸完毕后拔针，血止后取出阴道窥器。

行阴道后穹窿穿刺术时应严格观察患者病情变化，有无面色苍白、血压下降及剧烈腹痛等，穿刺时还应注意进针方向、深度，避免误伤子宫及直肠。