青霉素的作用主要是杀死细菌，对真菌无效。此外，每个人对青霉素的耐药性不同，如需使用青霉素，需在医生指导下使用。
青霉素类药物属于β-内酰胺类抗生素，主要通过阻断细菌细胞壁的合成来达到抗菌效果。青霉素类药物可以消除细菌，但不能消除真菌，主要是因为真菌和细菌的细胞壁成分不同。细菌的细胞壁由肽聚糖组成，真菌的细胞壁则由纤维素组成。青霉素类药物只能特异性识别肽聚糖，因此对真菌无效。如果想杀死真菌，可以使用广谱抗真菌药物，比如注射用两性霉素B、氟康唑分散片、伏立康唑片等。
青霉素类药物容易引起过敏反应，严重时还会导致过敏性休克，表现为呼吸困难、四肢发冷、血压下降、昏迷，抢救不及时可能会危及生命，所以皮肤过敏试验呈阳性者不能使用。此外，青霉素类药物对革兰氏阳性细菌的作用强，不应与氯霉素类药物、四环素类药物和大环内酯类药物一起使用。
患者需要严格按医生的指导服用青霉素类药物，不可私自滥用。在使用青霉素类药物后，建议患者不要喝酒，尽量不要饮用浓茶、碳酸饮料等，以免影响药物的吸收。