生理盐水可以通过高压蒸汽灭菌法进行消毒灭菌，高压蒸汽灭菌法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等，由于生理盐水耐高温、耐湿，需要彻底消毒灭菌应使用高压蒸汽灭菌法。
高压蒸汽灭菌法是可以杀灭所有微生物，包括芽胞在内的一种灭菌方法，要将需要进行灭菌的生理盐水放在高压灭菌锅内。在灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空，调整并确定灭菌时间与温度，而生理盐水的灭菌温度是121℃，灭菌时间是15分钟，加热时蒸汽不外溢，高压锅内温度会随着蒸汽压的增加而升高，取出生理盐水时，应先关闭电源，再打开高压灭菌锅的盖子，取出灭菌后的生理盐水后，需放在无菌室内进行自然冷却再放于冷藏冰箱内，并做好标记。
在进行高压蒸汽灭菌法时，灭菌前应该先检查灭菌器是否处于良好的工作状态，以保证操作安全。如果使用的老式高压灭菌锅，应关闭电源，打开气阀，将气体全部排空，压力为0时才能打开灭菌锅，避免发生事故。