益生菌早上和晚上都可以食用。益生菌在肠道局部起作用，并不能吸收入血，不存在早晨或晚上食用达到一定血药浓度才能起效的问题。益生菌进入肠腔后，可以定置到肠道内，起到调节肠道菌群，增加益生菌的作用。
益生菌往往是多个菌株复合，部分益生菌本身不能在肠道定置，如布拉氏酵母菌等，但它能帮助其他益生菌在肠道内定植，起到占位效应，使得周边益生菌更容易在肠道内生存。益生菌不是食用1-2次后就能达到效果，需要益生菌在肠道内有效定置，才能够起到应有的作用。
需要进食补充一定时间后，才能在肠道内集聚一定的量，达到应有效果，跟服用时间关系不是很密切。