MTX即甲氨蝶呤，甲氨蝶呤的化学结构与叶酸相似，对二氢叶酸还原酶具有强大而持久的抑制作用，其与该酶的结合力比叶酸大106倍，呈竞争性抑制作用。
药物与酶结合后，使二氢叶酸(FH2)不能变成四氢叶酸(FH4)，从而使5,10-甲酰四氢叶酸产生不足，使脱氧胸苷酸(dTMP)合成受阻，DNA合成障碍，也可阻止嘌呤核苷酸的合成，故能干扰蛋白质的合成。
临床上甲氨蝶呤用于治疗儿童急性白血病和绒毛膜上皮癌，鞘内注射可用于中枢神经系统白血病的预防和缓解症状。
该药物的不良反应包括消化道反应，如口腔炎、胃炎、腹泻、便血，骨髓抑制最为突出，可致白细胞、血小板减少，严重者可有全血下降。长期大量用药可致肝、肾损害，妊娠早期应用可致畸胎、死胎。
为减轻甲氨蝶呤的骨髓毒性，可在应用大剂量甲氨蝶呤一定时间后肌注甲酰四氢叶酸钙作为救援剂，以保护骨髓正常细胞。
因本品有致畸作用及从乳汁排出，故服药期禁怀孕及哺乳。如与乙醇和其他对肝脏有损害药物同用，可增加肝脏的毒性，因此用药期间应避免饮酒。