胰岛素瘤的诊断最准确的方法需结合Whipple三联征、72小时饥饿试验、血液检查、影像学检查、病理检查，进行综合判断。
一、Whipple三联征
这是胰岛素瘤定性诊断的重要依据。具体表现为低血糖症状发作，如心慌、手抖、饥饿感、出冷汗等交感神经兴奋症状，严重时可出现精神症状、意识障碍等；发作时血糖低于2.78mmol/L；供糖后低血糖症状迅速缓解。若患者具备这三个特征，高度提示胰岛素瘤可能。
二、72小时饥饿试验
作为胰岛素瘤的标准试验，该方法简单可靠。绝大多数患者在饥饿72小时内会出现低血糖发作，发作时测定血糖≤2.2mmol/L，胰岛素≥6μU/ml，C肽≥200pmol/L，胰岛素原≥5pmol/L，β-羟丁酸≤2.7mmol/L，且血/尿中无磺脲类药物的代谢产物，即可辅助诊断胰岛素瘤。
三、血液检查
同步检测血糖、胰岛素及C肽水平意义重大。当血糖＜2.8mmol/L时，若血清胰岛素＞6μU/ml，提示内源性胰岛素分泌过多，支持胰岛素瘤诊断。同时，C肽比胰岛素更能反映胰岛β细胞功能，空腹血浆C肽浓度高于0.35pmol/L时，也应考虑胰岛素瘤可能。
四、影像学检查
1、非侵入性检查
超声、CT和MRI等检查的定位准确性与肿瘤大小相关。因90%的胰岛素瘤直径＜2cm，常规检查阳性率低。但胰腺增强薄层扫描、三维重建和早期灌注等技术，可显著提高胰岛素瘤定位诊断的灵敏度和特异度，并评估肿瘤与血管、胰管的关系，为手术提供重要指导。
2、侵入性检查
选择性动脉钙刺激静脉采血（ASVS），通过向胰腺供血动脉注射葡萄糖酸钙促进胰岛素分泌，检测肝静脉血胰岛素水平，判断异常β细胞所在区域，定位效果较为准确，但属于有创操作，实施复杂，一般用于隐匿、探测困难的胰岛素瘤。
五、病理检查
通过手术或内镜获取肿瘤组织进行病理检查，是胰岛素瘤诊断的“金标准”，可明确肿瘤的性质和类型。但实际临床中，多需结合患者病史、症状、体征、实验室及影像学检查等多方面信息，进行综合判断，以进一步提高胰岛素瘤的诊断准确率。
确诊胰岛素瘤后，患者需及时接受治疗，手术切除是首选且唯一可能治愈的方法。随着医学技术的不断进步，胰岛素瘤的诊断和治疗手段也在不断完善，为患者带来了更好的预后。