25-羟基维生素D2属于机体内部维生素D的一种存在形式，但由于其含量较低，一般不单独测量，通常与25-羟基维生素D3进行综合测定，用于衡量体内的维生素D水平。健康人的正常水平范围是30-40ng/ml(70-100mol/L)。
与其他维生素D代谢物相比，血清中25-羟基维生素D(D2+D3)水平能更好地反映机体维生素D储存情况，其与维生素D缺乏的症状及体征的相关性也更强，因而测定25-羟基维生素D(D2+D3)被普遍认为是诊断维生素D缺乏症的最佳方法。其中，25-羟基维生素D3是维生素D在血液中的主要存在形式，主要依赖于皮肤产生和膳食摄入，其半衰期是3周，可特异性反映出人体几周到几个月内维素D的储存情况。
通常认为，血中25-羟基维生素D3<10ng/ml(25mol/L)为严重缺乏，<20ng/ml(50mmolL)为缺乏，在21-29ng/ml(52-72nmoL)之间为不足，≥30ng/ml(75nmol)为充足，其正常值上限为100ng/ml(250nmol/L)，而当>150ng/ml(375nmol/L)时，可发生中毒。