对于21-羟化酶缺乏症的高危人群，最好接受预防21-羟化酶缺乏症的相关筛查。发现呕吐、拒食、脱水、女性外生殖器男性化、阴毛早现、性早熟、月经紊乱等症状，应及时就医，明确是否为21-羟化酶缺乏症。
21-羟化酶缺乏症患者可优先考虑去内分泌科就诊，也可考虑就诊于儿科。
血清17-羟孕酮(17-OHP)
17-OHP升高是21-羟化酶缺乏症的特异性诊断指标和主要治疗监测指标。一般而言，17-OHP升高幅度越高，酶缺陷程度越重，病情就越严重。但17-OHP是应激激素，在有应激的情况下或患儿抽血哭闹严重时都可较实际水平有明显的升高。
基础血清皮质醇和促肾上腺皮质激素
经典型患者血清皮质醇降低伴促肾上腺皮质激素升高。也有患者皮质醇在正常范围，而促肾上腺皮质激素升高，需结合其他指标综合判断。21-羟化酶缺乏症非经典型患者两种激素基本在正常范围。
雄激素检查
该项检查必须考虑性别、年龄和青春发育期等因素，需建立的正常参照值判断。雄烯二酮的诊断和监测意义最佳。脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)在多囊卵巢综合征中亦可有升高。
血浆肾素浓度或肾素活性、血管紧张素Ⅱ和醛固酮
大部分患者会出现肾素升高，肾素是盐皮质激素替代治疗中的重要监测指标。醛固酮低下支持患失盐型21-羟化酶缺乏症的诊断，但有1/4患儿血清醛固酮可正常。
染色体
染色体主要用于诊断性发育异常问题。
影像学
肾上腺的B超和CT等影像学检查有助于鉴别21-羟化酶缺乏症和肾上腺肿瘤或其他肾上腺(发育不良)病变。女性应完善子宫、双附件B超，2岁开始需检查骨龄。
基因诊断
21-羟化酶缺乏症患者的基因诊断十分重要，能诊断杂合子携带者，对遗传咨询也非常重要。
临床表现
出生后发现外生殖器发育异常、吐奶、拒食、体质量不增；儿童或成人期出现性早熟、原发性闭经、月经紊乱不孕伴外生殖器色素沉着。非典型患者多在儿童期、青春期至成年期出现高雄激素表现，女性患者可有多个卵巢综合征表现。
辅助检查
基础17-羟孕酮值为200~1000ng/dL(6~30nmol/L)，且促肾上腺皮质激素激发试验结果<1000ng/dL(30nmol/L)；或基础17-羟孕酮值>1000ng/dL(30nmol/L)可诊断21-羟化酶缺乏症。雄激素检查、染色体检查、影像学检查、基因诊断等，可进一步明确诊断。
11β-羟化酶缺陷(CYP11B1基因突变)
11β-羟化酶缺陷也有高雄激素血症，极少有出生时失盐表现，常表现为水钠潴留、低血钾和高血压等，肾素-血管紧张素水平低，孕酮与17-OHP升高，但部分患者血压可正常。21-羟化酶缺乏症出上述表现外，还伴有脱水、腹泻、代谢性酸中毒等症状，必要时可行基因检测鉴别两者。
17α-羟化酶缺陷症(CYP17A1基因突变)
此酶同时还具有17,20-裂链酶的活性，临床表现为盐皮质激素增多的症状，如低血钾、高血压以及性激素不足的表现，或女性青春发育缺失，男性女性化。孕酮升高，17-OHP降低或正常。21-羟化酶缺乏症患者由于雄激素增多，出生时已有外生殖器男性化，男性病儿外生殖器多正常，失盐型促肾上腺皮质激素分泌明显增加时，患儿皮肤可有不同程度色素沉着，以外生殖器、乳晕、牙龈、皮肤皱褶处明显。
先天性遗传性肾上腺发育不良
先天性遗传性肾上腺发育不良是由于NR0B1基因或SF1基因突变导致的先天性肾上腺皮质功能减退，可合并性腺功能低下，其影像学多表现为肾上腺发育不良。21-羟化酶缺乏症患者青春期女性第二性征无发育、闭经、体毛重，可结合病史、体格检查及辅助检查，如盆腔和肾上腺超声检查、染色体核型分析、骨龄等明确诊断。
肾上腺皮质肿瘤
肾上腺皮质肿瘤(尤其是儿童)常以高雄激素血症的临床表现起病，伴或不伴皮质醇增多症，有17-羟孕酮显著升高，但促肾上腺皮质激素明显低下是鉴别要点，影像学证实占位病变。而21-羟化酶缺乏症患者生化检查提示促肾上腺皮质激素、17-羟孕酮、睾酮不同程度的升高，血或尿皮质醇减低，可行促肾上腺皮质激素兴奋试验明确。
多囊卵巢综合征
青春期或成年期因月经失调或高雄激素血症就诊的女性患者，非经典型先天性肾上腺皮质增生症的表现可与多囊卵巢综合征有一定重叠，可通过中剂量地塞米松抑制试验鉴别，必要时行CYP21A2基因检测以明确诊断。
